水产抗氧化肽研究进展(2)
3.1.2 发酵法
许多水产品经发酵后,在微生物和内源酶的作用下,有机物质转变成了小分子物质如肽类、氨基酸类和其它含氮化合物。其中的多肽和氨基酸不仅对发酵产物的风味起重要贡献,而且对产品的抗氧化功效起到贡献作用。发酵法与酶解法相比,能将微生物产酶和酶水解两步合一,省去酶的分离和提纯步骤,减少生产工序,降低成本。
RAJAPAKSE等[21]通过分离纯化紫贻贝Mytilus edulis发酵液,制备出具有重复序列“HFGBPFH”的多肽,经检测其具有较高的自由基清除能力、Fe2+螯合能力及提高氧化损伤细胞成活率的作用。PERALTA等[22]研究了菲律宾传统食盐发酵的虾Acetes spp酱的抗氧化性,结果证明通过适当延长发酵时间,在有效地增加自由氨基酸含量的同时,也提高了虾酱的抗氧化能力。
3.2 分离纯化及结构鉴定
从目前报道的水产品抗氧化肽来看,分子量多集中在1 000 Da左右,氨基酸残基的数目一般在20个以内,而且,在抗氧化肽粗品中,肽的种类较多,活性肽组分对外界环境条件也比较敏感,因此,分离纯化较困难,通常采用单一的分离纯化手段不能达到理想的分离效果。目前,普遍采用多种分离技术联用的手段。一般的分离纯化流程如图1所示。
图1 分离纯化流程图Fig.1 The flow chart of isolation and purification
超滤(UF)是膜分离技术的一种,实践证明膜技术具有耗能低、设备小、操作管理方便和质量好等优点。近年来,超滤技术已经被应用于水产品抗氧化肽的分离纯化。MENDIS等[13]采用10 kDa,5 kDa和3 kDa 3种膜截留鱿鱼皮明胶水解产物,初步筛选出小于3 kDa分子量的抗氧化活性最强组分。
离子交换色谱(IEC)是多肽分离纯化过程中经常采用的方法,它是以离子交换剂为固定相,根据流动相中组分离子与交换剂上平衡离子进行可逆交换时,结合力大小差异而进行分离的一种层析方法。很多的研究者采用SP-Sephadex C-25阳离子交换色谱分离水产品抗氧化活性组分。如狭鳕Theragra chalcogramma鱼排[20]、巨鱿鱼Dosidicus gigas肉[14]超滤活性组分等。
凝胶层析(GC)又称凝胶排阻色谱、分子筛层析和凝胶过滤等,是利用分子大小和形状差异进行分离的一种温和、高效的方法。Sephadex G-25凝胶柱层析是分离小分子量水产抗氧化肽采用的最多的一种,如乳酸发酵虾Penaeus mondon废弃物[7]。另外,有学者采用Superdex Peptide10/300 GL凝胶柱纯化牛蛙Rana catesbeiana Shaw[12]皮和草鱼Ctenopharyngodon idellus[15]水解物。
为了获得活性最高的多肽纯化物,通常采用高效液相色谱(HPLC)法进行分离纯化验证。高效液相色谱是近年来肽的分离纯化中广泛应用的技术,主要用于10 kDa以下的极性小分子肽的分离纯化。RAJAPAKSE等[21]采用nucleosil 100-7 C18 HPLC柱和Zorbax SB C18 HPLC柱两步分离,制得962 Da的活性最高抗氧化肽纯品。KIM等[16]将离子交换层析后的活性最高组分进一步经HPLC分离,分别采用了1次Capcell Pak C18UG-120柱和2次Synchropak RPP-100 RP-HPLC analytical柱,制得抗氧化肽纯品。对最终制得的高纯度抗氧化肽,通常采用质谱(CM)进行分子量的测定,推测其氨基酸序列。
4 水产抗氧化肽活性评估方法
评估水产抗氧化肽的活性,一般采用自由基清除能力、抗脂质自氧化能力、金属离子螯合能力、协同抗氧化能力等多种评价方法进行体外活性实验评估。经筛选出的具有抗氧化活性的物质可通过体内试验进一步检验评估。
4.1 清除自由基
自由基是指一类可以独立存在的含有未配对电子的物质,包括分子、原子、原子团或离子。主要包括超氧阴离子(O2-·)、过氧化氢(H2O2)、羟自由基(OH·)、单线态氧(1O2)等,这些自由基具有不稳定性和高反应性。抗氧化剂可以有效地将泄漏出来的、多余的活性氧等清除掉,从而保护细胞、组织免遭氧化损伤。
目前抗氧化肽的自由基清除效果,普遍采用自由基清除率来表示。二苯代苦味酰肼自由基 (1,1-diphenyl-2-picrylhydrazyl,简称DPPH)是一种较稳定的自由基。当有自由基清除剂存在时,DPPH自由基的单电子被分配而使其颜色变浅,利用分光光度法可以检测自由基清除情况,从而评价样品抗氧化能力。羟自由基是化学性质最活泼的活性氧自由基,它带有1个不成对的电子,是对人体毒性最大的自由基,它反应速度极快,可以与活细胞中的大分子如蛋白和DNA发生反应而造成损害[23]。因此,较多的研究者选用以上2种自由基的清除率来评估水产蛋白水解产物的抗氧化性。
文章来源:《水产科技情报》 网址: http://www.sckjqbzz.cn/qikandaodu/2021/0312/418.html
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